看360
含抗氨苄的重组质粒的大肠杆菌在平板上表达了，但是挑到含氨苄的液体培养基却不见长菌是怎么回事？
氨苄筛选有一些潜在的问题。
首先，让我们简单的了解一下氨苄筛选的基本原理。氨苄西林是一种广谱抗生素，可以杀死多种革兰氏阴性菌或是阳性菌。但是它也有自己怕的东西，那就是β-内酰胺酶（β-lactamase）。这种酶可以将氨苄结构中的四元内酰胺环β-内酰胺（β-lactam）水解，使其失去药性。基于这一特点，经过特殊设计的质粒都携带bla基因。转化成功的细菌会携带这种基因，从而表达β-内酰胺酶，在有氨苄西林的环境下生存下来。
但是现在问题来了：细菌产生的β-内酰胺酶是会分泌到细胞外的。随着细菌的生长，培养基中的β-内酰胺酶会不断增加，这时培养基内氨苄西林会被降解，浓度降低。筛选压力一旦消失或是变弱， 不带有抗性质粒的细菌，就有了可乘之机。
不知道大家在实验过程中是否会遇到过卫星菌落的现象？琼脂板培养时间过长时，会发现一个大菌落的周围会出现一些小的卫星菌落。卫星菌落是如何形成的呢？这是因为阳性克隆分泌了β-内酰胺酶，并在其周围积累聚集，降解了这个区域的抗生素，因此没有此质粒的小菌群则环绕而生。（你的菌落是否是卫星菌落呢？）
使用氨苄青霉素会产生的另一个问题是质粒丢失。细菌在传代的时候，会出现质粒丢失，传代次数越多，质粒丢失的可能性越大。对于其他抗生素如氯霉素，细菌如果丢失了部分带抗性的质粒，该菌在含有氯霉素的培养基中是不会生长的。但是对于氨苄则不然，在液体培养液中，培养时间过长的培养基中抗生素的浓度会降低，丢失了一部分质粒的细菌也可以在其中生长。
因此对于使用氨苄作为抗性标记的克隆，每隔一段时间需要检查细菌质粒丢失情况。比较直观的办法就是通过SDS-PAGE，如果发现蛋白质的表达水平降低了，很大可能是因为质粒丢失了。这时候需要重新转化重组载体。
进行氨苄筛选时需要注意一些事项。详情可以看我们的专栏文章
氨苄筛选为什么不靠谱？ - 专栏
含抗氨苄的重组质粒的大肠杆菌在平板上表达了，但是挑到含氨苄的液体培养基却不见长菌是怎么回事？
氨苄筛选有一些潜在的问题。
首先，让我们简单的了解一下氨苄筛选的基本原理。氨苄西林是一种广谱抗生素，可以杀死多种革兰氏阴性菌或是阳性菌。但是它也有自己怕的东西，那就是β-内酰胺酶（β-lactamase）。这种酶可以将氨苄结构中的四元内酰胺环β-内酰胺（β-lactam）水解，使其失去药性。基于这一特点，经过特殊设计的质粒都携带bla基因。转化成功的细菌会携带这种基因，从而表达β-内酰胺酶，在有氨苄西林的环境下生存下来。
但是现在问题来了：细菌产生的β-内酰胺酶是会分泌到细胞外的。随着细菌的生长，培养基中的β-内酰胺酶会不断增加，这时培养基内氨苄西林会被降解，浓度降低。筛选压力一旦消失或是变弱， 不带有抗性质粒的细菌，就有了可乘之机。
不知道大家在实验过程中是否会遇到过卫星菌落的现象？琼脂板培养时间过长时，会发现一个大菌落的周围会出现一些小的卫星菌落。卫星菌落是如何形成的呢？这是因为阳性克隆分泌了β-内酰胺酶，并在其周围积累聚集，降解了这个区域的抗生素，因此没有此质粒的小菌群则环绕而生。（你的菌落是否是卫星菌落呢？）
使用氨苄青霉素会产生的另一个问题是质粒丢失。细菌在传代的时候，会出现质粒丢失，传代次数越多，质粒丢失的可能性越大。对于其他抗生素如氯霉素，细菌如果丢失了部分带抗性的质粒，该菌在含有氯霉素的培养基中是不会生长的。但是对于氨苄则不然，在液体培养液中，培养时间过长的培养基中抗生素的浓度会降低，丢失了一部分质粒的细菌也可以在其中生长。
因此对于使用氨苄作为抗性标记的克隆，每隔一段时间需要检查细菌质粒丢失情况。比较直观的办法就是通过SDS-PAGE，如果发现蛋白质的表达水平降低了，很大可能是因为质粒丢失了。这时候需要重新转化重组载体。
进行氨苄筛选时需要注意一些事项。详情可以看我们的专栏文章
氨苄筛选为什么不靠谱？ - 专栏
含抗氨苄的重组质粒的大肠杆菌在平板上表达了，但是挑到含氨苄的液体培养基却不见长菌是怎么回事？
1. 用几块板子分别挑了几个菌？
2. 挑的菌养在几管液体lb里？
3. 所有板子挑在所有液体lb的菌都不长还是只有特定板子的不长？
a. 如果是所有都不长，看看是不是到板子的时候氨苄被烫坏了，或者液体lb氨苄浓度太高
b. 如果是一个板子挑的不长，看看是不是杂菌。比如如果氨苄是加在液体lb里以后倒的板子，加的时候lb已经很冷了以至于很可能没摇匀，最后倒出来的一块板子没多少氨苄，长出了空载
c. 其他离奇的原因：楼里有人养噬菌体，泄露了，etc
其他质控方案：挑菌的同时简易地保个菌（板子上点个点或者用ep管弄点lb沾一下都可以），然后出问题时（甚至转液体lb之前）拿去做个菌落pcr看还不是空载的
PS，要描述详细啊，哪些长了哪些不长的都说清楚才方便找原因啊
含抗氨苄的重组质粒的大肠杆菌在平板上表达了，但是挑到含氨苄的液体培养基却不见长菌是怎么回事？
1. 用几块板子分别挑了几个菌？
2. 挑的菌养在几管液体lb里？
3. 所有板子挑在所有液体lb的菌都不长还是只有特定板子的不长？
a. 如果是所有都不长，看看是不是到板子的时候氨苄被烫坏了，或者液体lb氨苄浓度太高
b. 如果是一个板子挑的不长，看看是不是杂菌。比如如果氨苄是加在液体lb里以后倒的板子，加的时候lb已经很冷了以至于很可能没摇匀，最后倒出来的一块板子没多少氨苄，长出了空载
c. 其他离奇的原因：楼里有人养噬菌体，泄露了，etc
其他质控方案：挑菌的同时简易地保个菌（板子上点个点或者用ep管弄点lb沾一下都可以），然后出问题时（甚至转液体lb之前）拿去做个菌落pcr看还不是空载的
PS，要描述详细啊，哪些长了哪些不长的都说清楚才方便找原因啊
含抗氨苄的重组质粒的大肠杆菌在平板上表达了，但是挑到含氨苄的液体培养基却不见长菌是怎么回事？
液体培养基里没长还算好事，当年被iGEM的R0051坑了几个月，转进去了，板上长了，挑到液体lb里也浑了，然而就是提不出质粒。换了两三个人做也提不出来，和别的part一起做别的都正常这个搞不出来。
最后判断是长了含Kana抗性的杂菌。鬼知道怎么来的。
含抗氨苄的重组质粒的大肠杆菌在平板上表达了，但是挑到含氨苄的液体培养基却不见长菌是怎么回事？
液体培养基里没长还算好事，当年被iGEM的R0051坑了几个月，转进去了，板上长了，挑到液体lb里也浑了，然而就是提不出质粒。换了两三个人做也提不出来，和别的part一起做别的都正常这个搞不出来。
最后判断是长了含Kana抗性的杂菌。鬼知道怎么来的。
含抗氨苄的重组质粒的大肠杆菌在平板上表达了，但是挑到含氨苄的液体培养基却不见长菌是怎么回事？
这问题太好解决了
问师兄哈哈哈
嗯，的确问师兄比问有用，毕竟不知道实际情况
含抗氨苄的重组质粒的大肠杆菌在平板上表达了，但是挑到含氨苄的液体培养基却不见长菌是怎么回事？
这问题太好解决了
问师兄哈哈哈
嗯，的确问师兄比问有用，毕竟不知道实际情况
含抗氨苄的重组质粒的大肠杆菌在平板上表达了，但是挑到含氨苄的液体培养基却不见长菌是怎么回事？
假阳性。你的平板放了多久了……
含抗氨苄的重组质粒的大肠杆菌在平板上表达了，但是挑到含氨苄的液体培养基却不见长菌是怎么回事？
假阳性。你的平板放了多久了……
